DIFFERENTIALBLUTBILDFÄRBUNG

Charakteristik

Die einfache und saubere Handhabung sowie die schnelle Färbung mit standardisierten Farbstoffen erlauben einen funktionellen Einsatz von Testsimplets® in Praxis und Klinik. Testsimplets® eignet sich besonders zur Untersuchung von Einzelproben und kleineren Serien, wie sie gerade in der Praxis des niedergelassenen Arztes, aber auch im Labor einer kleinen Klinik anfallen.

Darüber hinaus kann man den Befund des Differentialblutbildes mit Testsimplets® innerhalb kurzer Zeit auf der Station oder im Nachtdienst jeder Klinik erhalten. Ebenso kann das Ergebnis des Differentialblutbildes noch während der Konsultation in der Praxis vorliegen.

Klinik

Bei vielen Krankheitsbildern sind Veränderungen an Zahl und Gestalt der Blutzellen charakteristisch. Über Ausmaß und Art dieser Veränderung gibt neben anderen Befunden das Differentialblutbild gute Hinweise. Hieraus ergibt sich die klinische Bedeutung des Differentialblutbildes bei:

•  entzündlichen Prozessen (reaktive Verschiebung)
• Verdacht auf allergische Reaktionen (Eosinophilie)
• Verdacht auf Parasitenbefall (Eosinophilie)
• Kontrollen auf Arzneimittelnebenwirkungen
  (Agranulozytose, Thrombopenie)
• unklaren Lymphknotenschwellungen
  (z. B. Lymphozytose)
• unklaren generalisierten Blutungen (Thrombopenie)
• Verdacht auf leukämische Erkrankungen (pathologische
  Linksverschiebung)

Bei der Differentialblutbild-Färbung mit Testsimplets® werden gleichzeitig die Retikulozyten angefärbt. Die Retikulozyten spiegeln im peripheren Blut die Regenerationsfähigkeit der Erythropoese im Knochenmark wider. Sie können damit einen Hinweis auf den Erythozytenumsatz geben.

Der Nachweis einer Retikulozytose ist unter anderem wichtig:

• bei Verdacht auf hämolytische Erkrankungen
• zur Therapiekontrolle von Eisen-, Folsäure- oder
  Vitamin B12-Mangelanämien

Durchführung

Ein kleiner Blutstropfen (Kapillar- oder Venenblut) von ca. 3 μl wird auf die Mitte eines Deckglases aufgetragen und auf das Farbfeld des Objektträgers so gelegt, dass sich das Blut gleichmäßig nach allen Seiten verteilt. Mit Hilfe eines Stiftes kann durch Druck auf die Mitte des Deckglases eine gleichmäßige Verteilung der Probe bewirkt werden. Nach 15 Minuten Anfärbezeit kann das Präparat mit Ölimmersion bei 800–1000facher Vergrößerung differenziert werden. Bei Raumtemperatur ist das Präparat mindestens 4 Stunden haltbar. Kann eine mikroskopische Differenzierung des Präparates erst nach 4–24 Stunden durchgeführt werden, so sollte das Präparat sofort nach dem Anfertigen im Kühlschrank aufbewahrt werden.

Auswertung

Zur Auswertung sucht man im Präparat eine Stelle, an der die Blutzellen in so dünner Schicht liegen, dass sie leicht identifiziert werden können. Es werden 100 Leukozyten ausgezählt, indem man den Bereich der dünnen Schicht mäanderförmig durchfährt. Während des Mikroskopierens empfiehlt es sich, durch „Spielen“ am Feintrieb des Mikroskopes die Scharfeinstellung in den Leukozyten ständig leicht zu verändern. Besonders in Zweifelsfällen – wie sie bei der Identifizierung von Monozyten, Stabkernigen und Basophilen auftreten können – ist es wichtig, dass man die gesamte Zelle unter Scharfeinstellung einzelner Zellbereiche „durchfährt“.

Charakterisierung der Leukozyten

Nachfolgend werden die beim Gesunden im peripheren Blut auftretenden Leukozytenformen beschrieben:

Neutrophile Granulozyten
Im Zytoplasma erkennt man eine farblose oder zart violett gefärbte, feine Granulation. Die Kerne heben sich durch die leuchtend purpurne Färbung deutlich von dem granulierten Zytoplasma ab.

Stabkernige
Bei den stabkernigen Neutrophilen liegt der Kern stabförmig, d. h. ohne Segmentierung vor.

Segmentkernige
Die Kernform korreliert mit dem Reifegrad und entspricht den bekannten Befunden.

Eosinophile Granulozyten
Charakteristisch sind die Granula. Das Zytoplasma ist vollständig oder nahezu vollständig ausgefüllt mit deutlich abgrenzbaren, leuchtend gelbgrünen bis grünen
Granula. Gegenüber den Granula der Basophilen und Neutrophilen sind sie größer, transparent und wirken gequollen. Bei Verwendung von Achromaten herrscht
ein grünlicher Farbton vor. Bei den reifen Formen besteht der Kern häufig aus 2 hellpurpurnen Segmenten und hebt sich so farblich deutlich von den Granula ab.

Basophile Granulotyten
Charakteristisch für die Basophilen sind die unterschiedlich großen, meistens scharf begrenzten Granula, die purpurfarben, dunkelviolett oder orange bis braun gefärbt sind. Die violette Granula zeigen beim „Spielen“ am Feintrieb orangebraune Ringe an ihrer äußeren Begrenzung.

Monozyten
Im Vergleich zu dem gewohnten Bild sind sie deutlich kleiner. Das Zytoplasma wird mehr oder weniger purpur gefärbt. Es erscheint unscharf granuliert, ohne dass einzelne Granula abgrenzbar sind. Bei langen Anfärbezeiten kann es ebenso purpur wie der Kern werden. Die Konturen des Kerns bilden eine scharfe und eindeutig erkennbare Linie, die den Kern deutlich vom Zytoplasma abgrenzt.

Lymphozyten
Das Zytoplasma ist mehr oder weniger purpur und enthält keine Granula. Bei den kleinen Lymphozyten bildet es einen ganz schmalen, kaum erkennbaren Saum um den Kern.
Die Kernfärbung ist purpur. Das Chromatin erscheint schollig, an der Kernmembran verstärkt. Häufig erkennt man distinkte Nukleolen. Der Kern ist meistens rund. Funktionsformen der Lymphozyten (lymphatische Reizformen) können unterschiedlich verformte Kerne besitzen, die den Monozytenkernen sehr ähneln. Hierdurch wird die Beurteilung der lymphatischen Reizformen sehr erschwert.

Leukozyten-Frühformen
Im peripheren Blut werden auftretende Frühformen der Leukozyten erkannt, können aber nur schwer differenziert werden.

Charakterisierung anderer Blutzellen

Thrombozyten
Die Thrombozyten erkennt man als kleine purpurne Plättchen. Sie sind meist als Thrombozytenhaufen zu sehen, können aber auch einzeln vorliegen. Ausgeprägte Thrombopenien können erkannt werden. Erythrozyten Die Erythrozyten sind fahl gelbbraun gefärbt und fast alle aufgequollen. Verursacht wird diese Deformierung durch Farbstoffeinflüsse auf die vitale Zelle. Deshalb ist die Beurteilung der Erythrozytenmorphologie nicht zu empfehlen.

Eine Abschätzung des Hämoglobingehalts der Erythrozyten ist nicht möglich, Formen ohne Hämoglobinbildung können bei flüchtiger Betrachtung mit Lymphozyten verwechselt werden.

Retikulozyten
Die Retikulozyten sind ebenfalls deformiert. Ihre Färbung entspricht der der Erythrozyten. Die für die Retikulozyten typische Substantia granulo-filamentosa wird mehr oder minder intensiv purpur eingefärbt.

Retikulozytenzählung

Pro Gesichtsfeld werden alle Erythrozyten (also auch die Retikulozyten) gezählt und notiert. Anschließend wird im gleichen Gesichtsfeld die Zahl der Retikulozyten ermittelt. An verschiedenen Stellen des Ausstrichs werden so insgesamt 1000 Erythrozyten ausgezählt und die Retikulozyten in ‰ angegeben.

Antikoagulantien

Als Antikoagulans für Venenblut empfiehlt sich EDTA. EDTA-Blut darf bis zur Verarbeitung nicht länger als 3 Stunden bei Zimmertemperatur gestanden haben (keine Kühlschrankaufbewahrung). Bei Verwendung von Citrat-Blut kann es zu Überfärbungen kommen. Oxalat und Fluorid sind nicht geeignet, ebenso Heparinat und Blut von Patienten unter Heparintherapie.

KARZINOMZYTOLOGIE

Testsimplets® kann in der Klinik als Akut-Diagnostikum und in der Praxis als Vor-Diagnostikum in der Karzinomzytologie eingesetzt werden. Testsimplets® eignet sich hervorragend zur schnellen Anfärbung von karzinomverdächtigem Zellmaterial, z. B. in der Bronchialzytologie. Morgentliche Nativsputa, durch gezielte Absaugung erhaltene Sputa und Bronchialinhalte sowie Zellmaterialien anderer Herkunft (Punktionen von Pleura, Aszites, Perikard, Lunge oder Magenspülwasser) lassen sich nach wenigen Minuten Anfärbezeit unter dem Mikroskop beurteilen.

Durchführung

Nativsputum wird nach der Methode Kitasato-Mulder gewaschen. Mit einer Platinöse von 5 mm Durchmesser wird die gewaschene Sputumflocke auf Testsimplets® aufgetragen und nach sorgfältiger Ausbreitung mit einem Deckglas abgedeckt. Mit Hilfe eines Stiftes kann durch Druck auf die Mitte des Deckglases eine gleichmäßige Verteilung der Probe bewirkt werden.

Besonders zähflüssige Sputa benötigen für die Durchfärbung längere Zeit. Punktionsmaterial aus Körperhöhlen wird durch Zytozentrifugation angereichert. Bronchialinhalt, gewonnen bei gezielter Bronchialabsaugung, wird in physiologischer Kochsalzlösung aufgefangen und anschließend durch Zytozentrifugation angereichert. Danach wird ein kleiner Tropfen Sediment auf die Farbschicht von Testsimplets® aufgetragen und mit einem Deckglas abgedeckt. Nach einer Anfärbezeit von etwa 2–4 Minuten kann das Präparat unter dem Mikroskop beurteilt werden.Die Färbung des Präparates hält sich bei Zimmertemperatur 4 Stunden, bei Aufbewahrung im Kühlschrank ist die Beurteilung des Präparates bis zu 24 Stunden, bei sehr zähflüssigem Sputa auch noch nach 48 Stunden möglich.

Auswertung

Die mikroskopische Auswertung der Testsimplets®-Präparate wird nach den gleichen Beurteilungskriterien vorgenommen wie die konventionell gefärbten Präparate, entsprechend den Einteilungsgraden I bis V (nach Papanicolaou).

URINZYTOLOGIE

Mit Testsimplets® können außergewöhnlich gut Kernstrukturen, Kernmembranen, Chromatingerüst und Nukleolen sowie Zytoplasmastrukturen differenziert und klassifiziert werden.
Die Zytodiagnostik des Urins ist sinnvoll bei:

• allen Formen der Mikro- und Makrohämaturien
• Therapieresistenter Zystitis
• Zystalgie
• unklaren Dysurien
• Verlaufskontrolle nach Urotheltumor-Operationen
• Früherkennung und Verlaufskontrolle von Blasenkarzinomen

Die Beurteilung des Malignitätsgrades von Tumoren ist identisch mit der bei konventionellen Färbetechniken (nach Papanicolaou und Pappenheim).

Durchführung

Die Aufarbeitung des Harns ähnelt der Anfertigung eines normalen Urinsediments: Urin wird ca. 10 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig und vollständig dekantiert. Das Sediment wird in 3 Tropfen physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert.

Von dieser Suspension wird ein Tropfen direkt auf die Mitte eines der beigefügten Deckgläser aufgetragen und auf das Farbfeld gelegt. Mit Hilfe eines Stiftes kann durch Druck auf die Mitte des Deckglases eine gleichmäßige Verteilung der Probe bewirkt werden. Nach etwa 5–10 Minuten ist der Färbevorgang abgeschlossen und das Präparat kann untersucht werden; bei Raumtemperatur ist es bis zu 5 Stunden nach der Anfärbung auswertbar.

Auswertung

Die Durchmusterung der Präparate beginnt man zweckmäßigerweise bei 100facher Vergrößerung, um dann anschließend gezielt markante Zellen bzw. Zellformationen bei 200–400facher oder mit Ölimmersion bei 1000facher Vergrößerung beurteilen zu können. Aufgrund der Vitalfärbung erscheinen die angefärbten Zellen in ihrer natürlichen Größe, daher werden – im Vergleich mit anderen Methoden – Details besonders der Kernstrukturen und Kernmembran außergewöhnlich gut sichtbar gemacht.

LIQUORZYTOLOGIE

Testsimplets® färbt alle im Liquor auftretenden Zellen. Im Gegensatz zu konventionellen Techniken, wie z. B. Sedimentkammerverfahren und Zytozentrifugation, ist Testsimplets® als diagnostisches Routineverfahren für die Liquorzytologie geeignet:

•  schnelle Aufarbeitung und Isolierung der Liquorzellen
• geringes Liquorvolumen (20 μl Nativliquor)
• bereits normale Leukozytenzahlen (3–4 Zellen pro μl) werden ohne mechanische Anreicherung erfasst
• Gefahr der Zellyse und Zelldenaturierung erheblich verringert
• erhöhter Anteil differenzierbarer Zellen
  

  Durchführung

• 20 μl des durchmischten Liquors werden auf die Farbschicht von Testsimplets® aufgetragen. Das Deckglas wird unmittelbar danach so auf das Farbfeld gelegt, dass sich der Liquor nach allen Seiten gleichmäßig verteilt.
• Mit Hilfe eines Stiftes kann durch Druck auf die Mitte des Deckglases eine gleichmäßige Verteilung der Probe bewirkt werden. Nach 10–15 Minuten Anfärbezeit kann das Präparat differenziert
  Die Differenzierung muss innerhalb einer Stunde nach Anlegen des Präparates erfolgen. Bei Lagerung in einer feuchten Kammer bei +4°C (Petrischale) kann das Präparat bis zur Differenzierung 2 Stunden aufbewahrt werden. Bei Lagerung des Liquorpräparates bei –20°C beträgt die Haltbarkeit mindestens 2 Tage.

  Auswertung

• Die Auswertung des Präparates erfolgt mit Ölimmersion bei 800–1000facher Vergrößerung. Bei niedriger Leukozytenzahl werden 25–50, bei hoher 100 bis 200 Leukozyten ausgezählt. Die untere Erfassungsgrenze der Methode liegt bei 3–4 Leukozyten pro Mikroliter, also im Normalbereich.
  

  
  Charakterisierung der Leukozyten im Liquor

• Granulozyten
  Die neutrophilen Granulozyten zeigen violettbraune Kerne bzw. Kernsegmente mit Chromatinverdichtungen und rötlich bis rosa angefärbtes Zytoplasma mit gelblichbräunlichen Granula. Basophile Granulozyten zeigen typisch dunkelviolette Granula.
• Monozyten
  Zellen mit großem exzentrischem, ovalem, nierenförmigem oder gelapptem rotbraunem bis violettem Kern mit wabiger Struktur. Den Kern umgibt viel rosa-violettes, körniges Zytoplasma.
• Lymphozyten
  Zellen mit rundem, teils leicht eingebuchtetem Kern, der rotviolett bis braunschwarz angefärbt ist, mit deutlich erkennbaren grobscholligen Chromatinverdichtungen, umgeben von schmalem bis mittelbreitem rosa bis violettbraunem Zytoplasma ohne oder mit wenig erkennbaren Granula.
  Transformierte Lymphozyten unterscheiden sich von den mit unterschiedlichen Kerngrößen vorkommenden Lymphozyten durch reichliches rosa bis rotbraun gefärbtes Zytoplasma mit wenigen dunkler gefärbten Granula.
• Plasmazellen
  Zellen, mit großem rundlich-ovalem randständigem Kern von dunkelbrauner Farbe mit radspeichenförmigen Aufhellungen sowie viel rotbraun gefärbtem Zytoplasma mit wabigen Struktureinschlüssen.

ZYTOLOGIE DES NASENABSTRICHES

Testsimplets® eignet sich als einfache und sichere Screeningmethode, die in der rhinologischen Routinediagnostik angewendet werden kann. Bei der Differentialdiagnose der Rhinitis kann schon aufgrund der zytologischen Untersuchung unterschieden werden zwischen:

• bakteriellen
• viralen
• atrophischen
• allergischen und pseudoallergischen Entzündungen

Durchführung

• Mit einem Watteträger wird aus dem unteren und/oder mittleren Nasengang Sekret entnommen. Bei Kindern kann auch ausgeschnäuztes Sekret zur Untersuchung verwendet werden. Das Untersuchungsmaterial wird mit dem Watteträger auf das Deckglas von Testsimplets® aufgestrichen oder ausgerollt und leicht auf das Farbfeld der Objektträger gedrückt. Die Zeit zwischen Entnahme des Sekrets und dem Andrücken des Deckgläschens auf den Objektträger sollte möglichst kurz sein, da sonst die Feuchtigkeit fehlt, die zur Anfärbung der Strukturen
  nötig ist.

Auswertung

• Nach 15–20 Minuten Anfärbezeit können Zellstrukturen und Kristalle ausgewertet werden.

Beurteilung

• Normalbefund
  Im Nasenabstrich eines Gesunden sieht man neben Epithelzellen mit relativ kleinem Zytoplasma und großem Zellkern hauptsächlich Flimmerepithelzellen und Becherzellen.
• Neutrophile Granulozyten
  Der mikroskopische Nachweis von vermehrten Neutrophilen ist ein Beweis für eine Rhinitis, z. B. bakteriellen, viralen oder allergisch superinfizierten Ursprungs.
• Eosine Granulozyten
  „Eosinophilennester“ oder mehr als 30% eosinephile Granulozyten deuten auf eine anaphylaktische Allergie oder auf eine Analgetikaintoleranz hin.
• Basophile Zellen
  Zellen mit basophilen Granula sind geringer vertreten als Eosinophile. Das Vorhandensein basophiler Zellen, die entweder basophile Granulozyten oder Mastzellen darstellen, spricht für eine Rhinitis allergischer Genese. Basophile Zellen treten weiterhin auf bei gestörter nasaler Ventilation, z. B. bei Tumoren oder Polypen. Auch bei tracheotomierten Patienten oder laryngektomierten Patienten sind Basophile zu finden.
• Lymphozyten
  Bei akuten viralen Infekten treten vermehrt Lymphozyten auf.
• Riesenzellen und Ziliozytophorie
  Mehrkernige Riesenzellen deuten auf einen akuten viralen Infekt hin. Bei degenerativen Veränderungen von Flimmerzellen mit Zilienabbau wird von einer Ziliozytophorie gesprochen.
• Epidermoide Zellen
  Bei der atrophischen Rhinitis werden diese Zellen mit kleinem Zellkern und großem Zytoplasmahof gefunden.
• Kristalle
  Zerfallen Eosinophile, so entstehen die spindelförmigen Charcot-Leyden-Kristalle. Sie sind bei allergischer Rhinitis und auch bei Analgetikaintoleranz zu finden. Farnkrautähnliche Kristalle sind bei erhöhtem Natrium-
  Kaliumgehalt des Nasensekrets und bei gleichzeitigen verminderten Kolloidspiegeln zu finden. Diese Verminderung des Schutzfilmes zeigt eine beginnende Schleimhautatrophie im Spätstadium chronischer Rhinitiden an.

SPERMATOZOENFÄRBUNG

Bei der routinemäßigen Erstellung eines Spermiogrammes kann Testsimplets® die aufwendige Färbung nach Papanicolaou ersetzen.

Mit Testsimplets® ist die Färbung des frischen Ejakulats mit geringem Arbeitsaufwand möglich.

Durchführung

Je nach zu erwartender Spermatozoenkonzentration werden

5 μl (bei Spermienkonzentrationen von > 50 mill/ml)
10 μl (bei Spermienkonzentrationen von 10–50 mill/ml)
15 μl (bei Spermienkonzentrationen von < 10 mill/ml)

des verflüssigten Ejakulats auf die Mitte eines Deckgläschens aufgetragen und auf das Farbfeld des Objektträgers so gelegt, dass sich das Ejakulat nach allen Seiten gleichmäßig verteilt. Mit Hilfe eines Stiftes kann durch Druck auf die Mitte des Deckglases eine gleichmäßige Verteilung der Probe bewirkt werden. Die Spermatozoen sind nach ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur schwach angefärbt. Das Präparat sollte jedoch ca. 2 Stunden bei Raumtemperatur liegenbleiben; bis dahin ist der größte Teil der Spermatozoen unbeweglich und die Spermatozoen sind gut angefärbt. Anschließend wird die Differenzierung in normale und pathologische Formen vorgenommen. Bei Raumtemperatur ist das Präparat mind. 4 Stunden haltbar. Kann eine mikroskopische Differenzierung erst nach 4–24 Stunden durchgeführt werden, so ist das Präparat sofort nach dem Anfertigen im Kühlschrank aufzubewahren. Die Spermatozoen sind auch nach 20–24 Stunden bei +4 °C im Kühlschrank gut angefärbt.
Eine Fixierung der Ausstriche durch Einbettung mit Eukitt ist nicht möglich; die Spermatozoen sind anschließend nicht mehr differenzierbar.

Auswertung

Die Auswertung erfolgt bei 800–1000facher Vergrößerung mit Ölimmersion. Üblicherweise werden 200–500 Spermatozoen pro Präparat beurteilt und nach den Kriterien für normale und pathologische Formen in Prozenten dokumentiert.

Charakterisierung der Spermatozoen

Die Spermatozoen werden kontrastreich angefärbt. Sowohl Kopf- als auch Mittelteil und Schwanz sind gut zu erkennen. Der innerhalb des Kopfteils liegende Kern wird dunkelpurpur angefärbt. Das Plasma erscheint je nach Fokussierung orange bis hellviolett. Der Mittelteil erscheint bei pathologischer Vergrößerung ebenfalls hellviolett. Der Schwanzteil wird nur schwach angefärbt, ist aber deutlich zu sehen.

Normalwert

Über 60% morphologisch normal ausgebildete Spermatozoen.